Deciphering the functional role of EGR1 in Prostaglandin F2 alpha induced luteal regression applying CRISPR in corpus luteum of buffalo

BACKGROUND: PGF2α is essential for the induction of the corpus luteum regression which in turn reduces progesterone production. Early growth response (EGR) proteins are Cys2-His2-type zinc-finger transcription factor that are strongly linked to cellular proliferation, survival and apoptosis. Rapid elevation of EGR1 was observed after luteolytic dose of PGF2α. EGR1 is involved in the transactivation of many genes, including TGFß1, which plays an important role during luteal regression. METHODS: The current study was conducted in buffalo luteal cells with the aim to better understand the role of EGR1 in transactivation of TGFß1 during PGF2α induced luteal regression. Luteal cells from mid stage corpus luteum of buffalo were cultured and treated with different doses of PGF2α for different time durations. Relative expression of mRNAs encoding for enzymes within the progesterone biosynthetic pathway (3ßHSD, CYP11A1 and StAR); Caspase 3; AKT were analyzed to confirm the occurrence of luteolytic event. To determine if EGR1 is involved in the PGF2α induced luteal regression via induction of TGFß1 expression, we knocked out the EGR1 gene by using CRISPR/Cas9. RESULT: The present experiment determined whether EGR1 protein expression in luteal cells was responsive to PGF2α treatment. Quantification of EGR1 and TGFß1 mRNA showed significant up regulation in luteal cells of buffalo at 12 h post PGF2α induction. In order to validate the role of PGF2α on stimulating the expression of TGFß1 by an EGR1 dependent mechanism we knocked out EGR1. The EGR1 ablated luteal cells were stimulated with PGF2α and it was observed that EGR1 KO did not modulate the PGF2α induced expression of TGFß1. In PGF2α treated EGR1 KO luteal cell, the mRNA expression of Caspase 3 was significantly increased compared to PGF2α treated wild type luteal cells maintained for 12 h. We also studied the influence of EGR1 on steroidogenesis. The EGR1 KO luteal cells with PGF2α treatment showed no substantial difference either in the progesterone concentration or in StAR mRNA expression with PGF2α-treated wild type luteal cells. CONCLUSION: These results suggest that EGR1 signaling is not the only factor which plays a role in the regulation of PGF2α induced TGFß1 signaling for luteolysis.

Relationship between pregnancy rate and serum progesterone concentration in cases of porcine embryo transfer

The level of P4 at the time of embryo transfer (ET) is important. P4 concentrations and numbers of corpora lutea for 126 recipients were evaluated. Nuclear transfer embryos were transferred into 126 surrogates. 11 maintained their pregnancy until full-term delivery, 17 miscarried, and implantation failed in 98 animals. P4 levels in the full-term group were significantly different from those of the pigs that aborted or in which implantation failed (p < 0.05). However, the numbers of corpora lutea were not significantly different. These findings indicate that the concentration of progesterone can be an important factor for successful ET in pigs.

Efeitos do flunixin meglumine sobre parâmetros reprodutivos de vacas submetidas à inseminação artificial. ii- mecanismos da luteólise. revisão de literatura / Efectos del flunixin meglumine sobre parámetros reproductivos en vacas sometidas a la inseminación artificial. ii- mecanismos de luteólisis. revisión de literatura / The effects of flunixin meglumine on the reproductive parameters of artificial inseminated cows. ii- mechanisms of luteolysis: literature review

O principal papel do corpo lúteo (CL) é a produção de progesterona e uma adequada função luteal é crucial para determinar a duração do ciclo estral ou a manutenção e sucesso de uma possível gestação. A regressão do CL se dá em poucos dias, através de um processo chamado luteólise, que é desencadeado pela secreção de prostaglandina F2alfa (PGF2α). O conhecimento dos fatores ligados ao processo de regulação do corpo lúteo é importante para a manipulação do ciclo estral, na tentativa de aumentar a eficiência reprodutiva dos animais domésticos. Dentro desse contexto, este trabalho apresenta mecanismos relacionados à luteólise, que envolvem hipóteses sobre o fluxo sanguíneo uterino e ovariano, além do processo de morte celular por apoptose. Com o objetivo de se inibir a luteólise em ruminantes, avaliaram-se os efeitos do flunixin meglumine (FM) sobre a concentração sérica de progesterona, a taxa de gestação e a condição ovariana de vacas. Para tanto, 57 vacas foram divididas em grupos controle (GC n = 30) e tratado (GT n = 27), e submetidas à sincronização de estros (benzoato de estradiol IM e implante intravaginal de progesterona). Após sete dias, aplicou-se PGF2alfa IM, retirou-se o dispositivo intravaginal, e passadas 24h aplicou-se BE IM, sendo a IATF realizada 30h dessa aplicação. Os animais do GT foram submetidos diariamente a 1,1mg/kg de FM entre o 11º e 16º dia do ciclo estral (dia zero = IATF), enquanto os do GC receberam solução fisiológica. Amostras de sangue foram coletadas de todos os animais nos dias zero, seis, nove, 11 a 18 e 21, e 30 animais da raça nelore foram selecionados para dosagem sérica de progesterona por RIA. Os animais que retornaram ao estro foram re-inseminados e inseridos em seus grupos de origem. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassom transretal 30 dias após a IATF ou IA, quando também se avaliou a condição ovariana nos animais não gestantes, que foi repetida quatro dias após...

The main role of the corpus luteum (CL) is progesterone production and adequate luteal function is crucial to determine the duration or continuation of the oestrous cycle and success of a possible pregnancy. The regression of the CL occurs in a few days in the process called luteolysis, triggered by the secretion of prostaglandin F2alfa (PGF2 α). Know-how of factors associated with the process of corpus luteum regulating is important for the reproductive cycle manipulation in an attempt to increase the reproductive efficiency of livestock animals. This review brings information about the mechanisms of luteolysis, which involve assumptions on the uterine and luteal blood flow and the process of cell death by apoptosis. Flunixin meglumine (FM) has been used in an attempt to inhibit luteolysis in ruminants. Towards this aim, the effects of FM were assessed on the serum concentration of progesterone, the pregnancy rate and the ovarian condition of cows. Thus, 57 cows were divided into control group (CG - n = 30) and treated group (TG - n = 27) and submitted to estrus synchronization (estradiol benzoate IM and intravaginal progesterone-releasing insert). After seven days, PGF2α IM was administered, the intravaginal device was removed, and after 24h, BE IM was administered. FTAI was performed 30h after administration. Animals from the TG were daily submitted to 1.1 mg/kg of FM between the 11th and 16th days of the estral cycle (day zero = FTAI), whereas the animals from the CG received physiological solution. Blood from all animals was collected on days zero, six, nine, eleven through eighteen and twenty-one. Thirty animals from Nelore breed were selected for seric progesterone dosage by RIA. Animals which returned to the estrus were re-inseminated and inserted into their primary groups. Pregnancy diagnosis was carried out by transretal ultrasound 30 days after either FTAI or AI....

El principal papel del cuerpo lúteo (CL) es la producción de progesterona y una adecuada función luteal es crucial para determinar la duración del ciclo estral o el mantenimiento y el éxito de una posible gestación. La regresión del CL ocurre en pocos días, a través de un proceso llamado luteólisis, que es desencadenado por la secreción de prostaglandina F2alfa (PGF2α). El conocimiento de los factores relacionados al proceso de regulación del cuerpo lúteo es importante para la manipulación del ciclo estral, con la intención de aumentar la eficacia reproductiva de los animales domésticos. En este contexto, este trabajo presenta mecanismos relacionados a la luteólisis, que envuelven hipótesis sobre el flujo sanguíneo uterino y ovárico, además del proceso de muerte celular por apoptosis. Con el objetivo de inhibirse la luteólisis en rumiantes, se evaluaron los efectos del flunixin meglumine(FM) sobre la concentración sérica de progesterona, la tasa de preñez y la condición ovárica de las vacas. Para esto, 57 vacas fueron divididas en grupos control (GC n =30) y tratado (GT n = 27) y sometidas a la sincronización de estros (benzoato de estradiol IM e implante intravaginal de progesterona). Después de siete días, se aplicó PGF2 alfa IM, se retiró el dispositivo intravaginal, y pasadas 24h se aplicó BE IM, siendo la IATF realizada 30h después de esta aplicación. Los animales del GT fueron sometidos diariamente a 1.1mg/kg de FM entre el 11º y 16º día del ciclo estral (día cero = IATF), mientras los del GC recibieron solución fisiológica. Muestras de sangre fueron colectadas de todos los animales en los días cero, seis, nueve, 11 a 18 y 21, y 30 animales de la raza nelore fueron seleccionados para el análisis sérico de progesterona por RIA. Los animales que retornaron al estro fueron reinseminados e inseridos en sus grupos de origen. El diagnóstico de preñez fue realizado por ecografía transrectal 30 días después a la IATF o IA,...

Mecanismos endócrinos e moleculares envolvidos na formação do corpo lúteo e na luteólise - revisão de literatura / Endocrine and molecular mechanisms involved in the formation of corpus luteum and luteolysis - A Review

O corpo lúteo (CL) é uma estrutura endócrina transitória formada por células luteais esteroidogênicas pequenas (SLC) e grandes (LLC), que associadas aos fibroblastos e a uma ampla rede de capilares constituem uma estrutura especializada na síntese de progesterona (P4). De maneira geral, para a síntese de P4 nas células luteais esteroidogênicas, o colesterol se liga a receptores específicos na membrana celular e é transportado ao citosol. Posteriormente, o colesterol dirige-se a membrana mitocondrial interna e por ação da enzima P450scc transforma-se em pregnenolona. No retículo endoplasmático liso a pregnenolona é convertida a P4 pela enzima 3β-hidroxiesteróide deidrogenase (3β-HSD). A proteína de regulação aguda da esteroidogênese (StAR), o receptor benzodiazepínico tipo periférico (PBR) e a endozepina participam no transporte do colesterol para os diferentes compartimentos mitocondriais. Assim, supõe-se que a capacidade de síntese de P4 no CL esteja relacionada à concentração celular de receptores que captam o colesterol, às enzimas P450scc e 3β-HSD, e às proteínas celulares transportadoras de colesterol. Na espécie bovina, as LLC são responsáveis por mais de 80% da produção deste hormônio no CL. A menor concentração de proteínas transportadoras de colesterol na mitocôndria parecem limitar a síntese de P4 nas SLC. A P4 favorece um meio ambiente uterino apropriado para o desenvolvimento do(s) concepto(s), dependendo da espécie. Na maioria das espécies, a ausência da fertilização ou a incapacidade do concepto em sinalizar sua existência no útero estabelecem a luteólise. Tal evento fisiológico caracteriza-se pela regressão funcional e estrutural do(s) corpo(s) lúteo(s). Para o estabelecimento e a manutenção da prenhez torna-se necessário o bloqueio da luteólise por mecanismos que diferem entre as espécies. Em primatas e equídeos esse reconhecimento ocorre pela secreção de gonadotrofinas específicas e em ruminantes pela presença de fatores ...

The corpus luteum (CL) is a transitory endocrinal structure formed by steroidogenic small luteal cells (SLC) and large luteal cells (LLC) that associated with fibroblast and a wide web of capillaries form a structure specialized in synthesis of progesterone (P4) In general, for the synthesis of P4 in the steroidogenic luteal cells, cholesterol joints specific receptors on the cellular membrane and is transported to the cytosol. Later, cholesterol goes to an internal mitochondrial membrane and by the action of the enzyme P450scc is transformed into pregnenolone. In the smooth endoplasmic reticulum pregnenolone is converted to P4 by the enzyme 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3 β -HSD). The steroidogenic acute regulatory protein (StAR), the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) and endozepine participate in the transport of cholesterol to the different mitochondrial compartments. Therefore, it is supposed that the capacity of synthesis of P4 in the CL is related to the cellular concentration of receptors that catch cholesterol, to the enzymes P450scc and 3β-HSD and to the cholesterol cellular transport proteins. In bovine, the LLC are responsible for more than 80 of P4 production in the CL. The lowest concentration of cholesterol transport proteins in the mitochondria seems to limit the synthesis of P4 in the SLC. P4 supports a proper uterine environment for the development of conceptuses, depending on the specie. In most species, the lack of fertilization or the conceptus incapacity to signalize its presence in the uterus establishes luteolysis. This physiolocal event is characterized by the functional and structural regression of the CL. For the establishment and maintenance of pregnancy it is necessary to block luteolysis through different mechanisms among species. In primates and equids it occurs by the secretion of specific gonadotropins and in ruminants by antiluteolytic factors. This review has the objective to characterize the endocrine ...

Angiogénesis en la fisiología reproductiva. Desarrollo folicular, formación y mantenimiento del cuerpo lúteo / Angiogenesis in reproductive physiology. Follicular development, formation and maintenance of the corpus luteum

The process of new capillary formations from previously existing mature vessels in healthy individuals has been mainly studied during cycles of the female reproductive tract. This new capillary formation, known as angiogenesis is related to endogenous regulators that both stimulates or inhibits it. Knowledge on the role of both stimulators and inhibitors under physiological and pathological conditions accentuates a main role of VEGF, FGF, angiogenin and angiopoietics among the formers; and main role of angiostatin and endostatin among the latters. In recent years, angiogenesis in the ovaries that leads to follicular and luteal growth and development has been extensively studied. Whether a number of endogenous stimulators and inhibitors have been identified, the molecular link between the endocrine and vascular system is not fully understood. Therefore, efforts to formulate questions that need answers must be made.

Sexual behavior and fertility of male rats submitted to prolonged immobilization-induced stress

In order to investigate whether prolonged stress interferes with the onset of sexual behavior at puberty and with fertility at adulthood, prepubertal male Wistar rats (40 days of age) were immobilized 6 h a day for 15 days (up to early puberty) or for 60 days (until sexual maturity). Pubertal stressed rats showed a two-fold increase in the latency for the first mount (probably due to repeated aversive experience in which a change of environment was always followed by immobilization) and a 2.5-fold increase in the frequency of thrusting (indicative of enhanced sexual performance). The apparently stimulatory effect of prolonged stress on the onset of sexual behavior is discussed in terms of increased testosterone level and interference with the complex interchanges between the neurotransmitters/neuropeptides involved in the central control of male sexual activity. Adult stressed animals were mated with normal females, which became pregnant but exhibited a more than two-fold increase in both pre-implantation and post-implantation loss, probably due to a smaller rate of fertilization and/or fertilization with damaged spermatozoa

O sistema renina-angiotensina em ovário / The renin-angiotensin system in ovary

Além das gonadotrofinas e esteróides gonadais, outros fatores participam da regulação da função ovariana; entre estes incluem-se fatores de crescimento e diversos peptídeos regulatórios, como os peptídeos natriuréticos e o sistema renina-angiotensina (SRA). Além do conhecido SRA sistêmico, vários órgãos, entre eles os ovários, contêm SRA locais. Todos os componentes do SRA foram descritos em ovários: angiotensinogênio, angiotensina-I, angiotensina-II (Ang-II), renina, enzima conversora de angiotensina (ECA) e receptores AT 1 e AT 2 . A Ang-II estimula a ovulação, maturação dos oócitos e produção de estradiol, progesterona e prostaglandinas; a produção de Ang-II, por sua vez, é estimulada pela hCG. Entretanto, a inibição da produção de Ang-II por inibidor de ECA não altera a esteroidogênese ou a ovulação. Tais efeitos poderiam ser devidos à angiotensina-(1-7), um peptídeo do SRA cuja formação pode ocorrer independente da ECA. Resultados preliminares mostram que a angiotensina-(1-7) estimula a produção de estradiol in vitro. Finalmente, há evidências da participação do SRA em disfunções ovarianas, tais como a síndrome de hiperestimulação ovariana (SHO) e a síndrome dos ovários policísticos (SOP). Na SHO foi demonstrado que o tratamento com gonadotrofinas estimula o SRA ovariano e que o uso de inibidores da ECA diminui a incidência e a gravidade da síndrome. Na SOP foi demonstrado aumento de renina e Ang-II ovarianas, enquanto o aumento da pró-renina plasmática se correlaciona com a concentração de andrógeno, uma característica básica da síndrome. Assim, o SRA parece ser um sistema importante na fisiologia e fisiopatologia ovariana.

Distribución diferencial de células cebadas en el cuello uterino de cerdas con desarrollo folicular y cuerpo lúteo ováricos / Differential distribution of mast cells in cervix uteri of sows with folicular development and ovaric corpus luteum

Diversos hallazgos experimentales sugieren la participación de las hormonas esteroides ováricas sobre la regulación de la población de células cebadas (CC) en órganos del aparato reproductor femenino. Con el propósito de conocer la distribución de la población de células cebadas en tres porciones anatómicas del cuello uterino (CU) de cerdas con diferentes características morfológicas ováricas, se estudiaron los CU de 20 cerdas púberes clínicamente sanas, 10 con desarrollo folicular y las restantes con cuerpo lúteo funcional. Se tomaron fragmentos de 2 cm2 de los segmentos craneal, medio y caudal del CU y se procesaron mediante la técnica de inclusión en parafina. Los cortes fueron teñidos con azul de tolouidina y posteriormente se contaron las CC presentes por mm2. Hubo diferencia estadística significativa (P< 0.05) entre los tres segmentos anatómicos estudiados, en las dos fases del ciclo estral, resultando una mayor cantidad de CC en el CU de cerdas con desarrollo folicular respecto de las cerdas con cuerpo lúteo. En cada fase se encontró diferencia significativa entre el segmento craneal con respecto a los dos segmentos anatómicos restantes. Estos resultados sugieren que la dinámica funcional de las CC del CU de la cerda varía dependiendo de su porción anatómica y de la condición morfofuncional ovárica que predomina en determinado momento del ciclo estral

Cuerpo lúteo hemorrágico: oveja con piel de lobo / Haemorragic corpus luteum

Se presentan 11 pacientes con diagnóstico ecográfico presuntivo de hemorragia del cuerpo lúteo (HCL) en quienes se comprobó desaparición espontánea de la lesión en controles posteriores

Ultrastructural changes in the corpus luteum of Egyptian buffalo-cows during different phases of the oestrous cycle

In this work, the relationship between histological structure of corpus luteum and steroid hormones during estrous cycle of buffalo- cows was studied. Corpora lutea and blood samples were collected from slaughtered animals. The corpora lutea were prepared for a histological examination using electron microscope, while progesterone and estradiol-17 beta were estimated from serum. The results revealed a relation between fine structure of lutein cells and concentrations of progesterone during the same stage of the estrous cycle. The main change which occurred in the cytoplasm of the lutein cells was variation of the number of the secretory granules. After metestrus phase and during the diestrus one, levels of progesterone increased gradually and the cytoplasm of the lutein cells became vacuolated containing lipid droplets, electron dense granules, numerous mitochondria and SER. At estrus phase, a significant sharp decrease of progesterone and a rise of estradiol-17 beta were associated with severe changes in luteal cells of corpus albicans containing numerous lipid droplets of different sizes and empty spaces, followed by a disintegration of the cytoplasm which became cornified

Concentração de progesterona peripuberal em novilhas mestiças / Peripuberal progesterone concentration in cross breed heifers

O presente estudo reporta observações sobre idade, peso e concentração plasmática de progesterona em novilhas mestiças (zebu x holandês) durante o período peripuberal. As médias de idade e peso na puberdade foram 29,1-2,0 meses e 326-19,2 kg respectivamente. Dos cinco animais acompanhados, dois apresentaram elevações transitórias de progesterona (entre 0,5 e 1,0 ng/ml) anteriores à puberdade. Dentre os que não apresentaram elevação transitória, dois tiveram corpo lúteo de baixa produção de progesterona (1,2 e 1,6 ng/ml) após a primeira ovulação e um apresentou corpo lúteo de longa duração (acima de 28 dias). Os dados observados indicam que as elevações transitórias de progesterona anteriores à puberdade podem ocorrer ocasionalmente, no entanto parece ser necessária a instalação de uma função luteal competente após o primeiro cio.

The present study reports on age, body weight and pre-liminary observations on the plasmatic progesterone leveis in cross-breeding heifers (zebu x holstein) during peripuberal period. The mean age and body weight of tive heifers at puberty were 29.1-2.0 months and 326.8-19.2 kg respectively. Two of tive heifers exhibited after the first estrous low progesterone productive corpus luteum (1.2 and 1.6 ng/ml) and the third heifer exhibited one long-lived corpus luteum (>28 days long). The data observed in this study indicated that transiente increases of plasmatic progesterone prior puberty can not occur but should be necessary for the competent luteal funtioh, after the first estrous.

Prostaglandinas e reproduçäo: uma revisäo / Prostaglandins and reproduction: a review

Neste trabalho, os autores fazem uma revisäo dos possíveis mecanismos de açäo das prostaglandinas em diversos eventos relacionados às funçöes reprodutivas, tais como maturaçäo do oócito, mecanismos envolvidos na ruptura folicular, na manutençäo e regressäo do corpo lúteo, implantaçäo, transporte do oócito/zigoto através das trompas e na menstruaçäo.

El papel de los esteroides en el desarrollo folicular del mamífero / Steroids role in mammal follicular growth

El propósito de esta revisión es conocer la regulación del desarrollo folicular, la ovulación y del cuerpo lúteo por medio de la síntesis de esteroides en el folículo. La esteroidogénesis ovárica y el desarrollo folicular junto con los mecanismo de control neuroendocrino involucrados en la secreción de gonadotropinas actúan para producir una serie de eventos endocrinológicos y morfológicos que tienen como finalidad la producción de un ovocito completamente maduro y capaz de ser fecundado

Evidencia de actividad luteotrópica de la gonadotropina coriónica en pacientes sometidas a estimulación ovárica controlada / Evidence of luteotropic activity of chorionic gonadotropin in patients with controlled ovaric stimulation

Se realizó un estudio en 47 pacientes con esterilidad a las que se les realizó hiperestimulación ovárica controlada con menotropinas, y se les administró gonadotrofina coriónica (hCG) para determinar la actividad luteotrópica. Se dividieron en dos grupos: Grupo 1; 23 pacientes con suplemento de fase lútea con (hCG). Grupo 2; 24 pacientes sin suplemento. Se determinó progesterona sérica el día 21 del ciclo en ambos grupos, habiendo encontrado una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05), en los niveles de esta hormona, siendo mayor su secreción en el Grupo 1. Se comunican siete embarazos; cinco del Grupo 1, y dos del Grupo 2

Comparaçäo entre os diversos métodos utilizados na prática clínica para avaliaçäo da fase lútea / Comparison of different methods used in clinical practice for luteal phase evaluation

Neste trabalho, avaliamos a metodologia empregada para o diagnóstico dos defeitos da fase lútea em dois ciclos consecutivos; e pelos achados concluímos que a biópsia de endométrio é o melhor método de que dispomos na prática clínica. A dosagem da progesterona plasmática deve ser utilizada como um método complementar no seu diagnóstico.

Eventos fisiólogicos en el ciclo ovárico normal de ratas: aspectos actuales / Physiological events during the normal ovarian cycle in rats: current aspects

La presente revisión tiene por discutir los fenómenos fisiológicos ocurridos en el ciclo ovárico normal de ratas, describiendo el desenvolvimiento de los folículos pre-ovulatorios, las principales hormonas esteroides y gonadotróficas involucradas en este proceso, así como la acción de estas hormonas, a través de su unión a receptores localizados en las células de la granulosa y/o tecales y las modificaciones hormono-dependientes del contenidode tales receptores son también discutidos. La formación del cuerpo lúteo, su posterior regresión y el fenómeno de atresia folicular

Niveles de progesterona plasmática durante los primeros siete días postinseminación en vaquillas Holstein repetidoras y de primer servicio / Progesterone concentration in plasma from repeat-breeding and first-service Holstein heifers during the first 7 days postinsemination

Se evaluó la función lútea durante los primeros siete días siguientes al servicio en vaquillas Holstein repetidoras y de primer servicio. Con este objeto se formaron dos grupos; el primero con 12 vaquillas de primera servicio y el segundo con 18 vaquillas repetidoras. Todos los animales fueron sangrados diariamente desde el día de la inseminación hasta el día 7 posinseminación. La sangre heperinizada se centrifugó inmediatamente después de su obtención para separar el plasma, el cual se procesó por radioinmunoanálisis para determinar los niveles de progesterona. Las concentraciones de progesterona plasmática no difirieron (P> 0.05) entre vaquillas repetidoras y de primer servicio en ninguno de los días evaluados. Asimismo, se compararon las concentraciones de progesterona entre vaquillas que quedaron gestantes y aquellas que no concibieron, sin encontrar diferencias (P> 0.05). En este estudio nada evidenció que la deficiencia en la función del cuerpo lúteo durante los primeros siete días postservicio, sea una causa significativa de infertilidad en vaquillas Holstein.